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Invasión de Escherichia coli septicémica aviar a células epiteliales en cultivo. Laura Libier Salazar Serrano, Luz Elena
Vidales Rodríguez, Yolanda Almanza Márquez y Rosa María
Ramírez Santoyo*. Resumen Antecedentes: Escherichia coli es parte de la flora normal de intestino en diferentes animales y en el hombre, sin embargo, algunas cepas que portan atributos genéticos de virulencia pueden causar enfermedades intestinales o extraintestinales (1-3). En aves, E. coli extraintestinal aviar produce diferentes síndromes, entre los que destaca la septicemia y la enfermedad respiratoria, las cuales causan una elevada morbilidad y mortalidad produciendo pérdidas económicas, principalmente en la industria del pollo de engorda, no solo por la mortalidad sino por los costos del tratamiento, baja conversión alimenticia y decomisos en la inspección de carne (4-8). Además, no existen vacunas eficaces, ya que aunque experimentalmente se han producido, los beneficios han sido muy limitados porque solo protegen contra la cepa homóloga de la cual derivaron (4,9-12). Existen numerosos reportes que han elucidado que la principal vía de entrada de la bacteria es la aérea, debido a la inhalación de polvo contaminado con heces, y aún cuando se sabe que un gran porcentaje de las cepas septicémicas aviares tienen la capacidad de adherirse a células epiteliales traquéales (4,13-19), se desconoce cuales son los eventos posteriores que le permiten a la bacteria diseminarse. Algunos investigadores han propuesto que lesiones previas causadas por agentes infecciosos primarios como virus y/o micoplasmas pudieran ocasionar un daño a los cilios traqueales que facilitan la diseminación del patógeno, sin embargo, experimentalmente en aves libres de microorganismos se ha reproducido la enfermedad (5,19). Entre los mecanismos asociados a la patogenicidad de E. coli patógena aviar (APEC) destacan la fimbria tipo 1, el plásmido ColV y la motilidad que frecuentemente se han asociado a la capacidad de colonizar células epiteliales traqueales (4,14-17,20,21). Otras características que han sido estudiadas en estas cepas son diversas moléculas de superficie, interacción con fagocitos y con el complemento, así como la capacidad para el secuestro de hierro (4,21-23). Hasta hace poco los factores de virulencia eran analizados considerando solo al patógeno, sin embargo en la actualidad se reconoce que para entender la fisiopatología de las enfermedades infecciosas es fundamental conocer la relación que se establece entre el patógeno bacteriano y la célula huésped en un medio ambiente determinado (24-26). A pesar de que se le está prestando gran atención a las características fenotípicas y genotípicas de virulencia asociadas a las cepas aviares de E. coli causantes de enfermedades extraintestinales, se conoce muy poco de las interacciones que ocurren con las células epiteliales del huésped después de la colonización bacteriana, y de los mecanismos que le permitan alcanzar el torrente circulatorio y causar la septicemia que generalmente provoca la muerte. La capacidad de invadir el epitelio es un factor de virulencia de varios patógenos bacterianos intracelulares obligados así mismo de aquellos microorganismos extracelulares que pueden penetrar a estructuras de eucariontes (25-29). In vivo algunos microorganismos invaden a células epiteliales a través del proceso de fagocitosis inducida por la bacteria (27,30,31), durante la invasión a superficies mucosas, las células M que son células epiteliales con capacidad fagocítica juegan un papel importante en epitelios simples y pseudoestratificados (32). Las bacterias capaces de invadir epitelios han desarrollado mecanismos que varían desde el tránsito simple, destrucción epitelial por efecto de sus enzimas y/o toxinas e incluso pueden inducir eventos de transducción de señales en la célula huésped para promover su internalización, la cual in vivo puede tener como resultado el procesamiento del antígeno y la activación de la respuesta inmune ó la infección de mucosas y la propagación sistémica de la bacteria como sería el caso para Salmonella typhi y Shigella flexineri, entre otras (32, 34,35). El entendimiento de los mecanismos de invasión bacteriana a los epitelios, implica el análisis de la relación que se establecen entre la bacteria y la célula huésped, es decir la comunicación entre el patógeno bacteriano-célula huésped (24), este evento refleja un balance co-evolutivo para asegurar la propia sobrevivencia, por lo tanto no es sorprendente que las bacterias desarrollen entre sus factores de virulencia, mecanismos para interferir o estimular respuestas fisiológicas de la célula huésped, la interacción no es unidireccional sino que se establece una verdadera comunicación bioquímica en donde se vierten respuestas de ambas partes, en varios casos este evento es mediado por un aparato de secreción designado a exportar y/o liberar una serie de moléculas efectoras bacterianas en la célula huésped como es el aparato de secreción tipo III y ha sido reportado en algunas enterobacterias (24). Entre las proteínas secretadas por este sistema algunas juegan un papel en la patogénesis bacteriana (36). Recientemente se ha reportado que las cepas de Escherichia coli extraintestinal causante de infecciones del tracto urinario en humanos son capaces de penetrar a células eucariotas (31) Además se conoce que en estas cepas la fimbria tipo 1 media tanto la adherencia como la invasión a células epiteliales de vejiga urinaria, recientemente se ha demostrado que las cepas que expresan esta fimbria invaden las células epiteliales que delinean el lumen de la vejiga y subsecuentemente se replican formando focos masivos de E. coli intracelular (37). Así mismo, se ha encontrado que cepas de E. coli causantes de la meningitis del recién nacido en humanos, tienen la capacidad de atravesar la barrera hemato-encefálica y que pueden inducir rearreglos del citoesqueleto en células endoteliales (38). Al respecto, se ha reportado que en estas cepas de E. coli una proteína, la Ibe10 es indispensable para la invasión de esta bacteria a células endoteliales (39) y también se ha identificado al locus ibeB para que ocurra este evento (40). Recientemente estudios con E. coli K1 han demostrado que varios determinantes microbianos como la cápsula K1, la proteína de membrana externa A, las proteínas Ibe, y otros factores como AsIa, TraJ y CNF1 contribuyen a la invasión de células endoteliales, evento que es requerido para la penetración en el SNC en la meningitis hematógena experimental (41). En las cepas de E. coli septicémicas aviares no se ha reportado como alcanza el torrente circulatorio después de colonizar el epitelio traqueal; de acuerdo a los conocimientos de la patogenia de la enfermedad, las vías potenciales de invasión podrían ser a nivel del epitelio traqueal o la invasión del endotelio a nivel de áreas de intercambio gaseoso en el pulmón, por lo que creemos que es importante analizar el evento de invasión o penetración a células epiteliales in vitro por cepas de E. coli aviar. En este trabajo se investigó, la capacidad de internalización de cepas de E. coli septicémica aviar a células HeLa en cultivo. Material y métodos: Microorganismos: Cuadro 1.- Fenotipos asociadas a la patogenicidad en cepas de E. coli.
Fuente (42) Líneas
celulares y condiciones de cultivo. Susceptibilidad
y resistencia a la gentamicina Inoculo
bacteriano Ensayos
de invasión
Cuantificación
de UFC
Resultados: Estandarización de inoculo bacteriano: Bajo las condiciones antes descritas, se ajusto el inoculo bacteriano para la infección de las monocapas de células HeLa. La cuantificación de UFC de la suspensión bacteriana de las cepas de estudio a una absorbancia de 1.5 (DO620) se muestran en el cuadro 2. Cuadro 2. Estandarización del inoculo bacteriano
Internalización de cepas APEC a células HeLa: Las cuatro cepas APEC analizadas tuvieron la capacidad de invadir a las células HeLa, la invasión fue aumentando con respecto al tiempo, como se muestra en el cuadro 3. Cuadro 3. UFC liberadas por el Tritón X-100 al 0.1%
Eficiencia de invasión: Se calculo el porcentaje de invasión de las cepas APEC a células HeLa de acuerdo a lo descrito por Leclerg (44). Los resultados se muestran en el cuadro 4. Cuadro 4. Eficiencia de invasión de cepas APEC a células HeLa
Discusión: En la colisepticemia aviar se conoce muy poco de las interacciones que ocurren entre las bacterias y las células epiteliales durante la colonización, así mismo se desconocen los mecanismos que le permiten a la bacteria alcanzar el torrente sanguíneo y causar la septicemia. E. coli aviar es considerado un patógeno extracelular, sin embargo, en este trabajo se demostró por ensayos de protección con gentamicina que las cepas bacterianas analizadas pueden penetrar a células HeLa en cultivo. Las cuatro cepas de estudio mostraron tener la capacidad de invadir células HeLa; adicionalmente se observó que el periodo de incubación es importante en la eficiencia de la invasión; el número de bacterias intracelulares se incremento con la extensión del periodo del ensayo. En estudios de invasión in vitro a células endoteliales y epiteliales por cepas de E. coli que causan meningitis del recién nacido, se ha reportado que una baja eficiencia de invasión durante la primera hora de infección y el incremento en periodos subsiguientes puede reflejar la necesidad de la inducción en la expresión de genes bacterianos esenciales para una internalizacion eficiente, o bien puede deberse a un lento proceso de transducción de señales que conducen a la activación de la maquinaria de internalizacion a la célula huésped (28) por lo que no se descarta monitorear este proceso durante periodos mas largos en ensayos de infección con E. coli aviar a monocapas de células epiteliales. Para conocer si este evento de invasión a células HeLa por cepas APEC es un mecanismo de patogenicidad deberán realizarse estudios comparativos con cepas no patógenas de E. coli aviar. Por otra parte se ha reportado que algunos factores de virulencia participan en la internalizacion; así para el caso de E. coli uropatógena se atribuye a la fimbria tipo I un papel esencial en este proceso (37) y OmpA para E. coli causante de la meningitis; en este sentido las bacterias utilizadas en este estudio han sido parcialmente caracterizadas en función de algunos factores de patogenicidad sin embargo será necesario realizar ensayos adicionales para correlacionarlos con el proceso de invasión. Así mismo será importante analizar la eficiencia de invasión utilizando diferentes proporciones bacteria-célula (multiplicidad de la infección), ya que en este ensayo fue muy baja (1:1). Otro punto interesante será analizar la eficiencia de invasión de cepas APEC a otras líneas celulares o a células de origen aviar obtenidas por cultivos primarios. Literatura citada 1.- Miller L, Kaper B, Portnoy A, Isberg R. Molecular genetics of bacterial Pathogenesis. ASM Press. 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