Diferentes fenotipos curli en cepas patógenas aviares de Escherichia coli.

Vicente Ramírez Castañeda , Rosa María Ramírez Santoyo*, Yolanda Almanza Márquez*.
Departamento de Enfermedades Infecciosas de la Unidad Académica de Biología Experimental de la Universidad Autónoma de Zacatecas. Calzada de la revolución mexicana s/n Col. Tierra y Libertad. Guadalupe, Zacatecas, C.P. 98600, Tel. y Fax: (014)92-1-13-26. *Correspondencia: E-mails:colv21@hotmail.com y romaras@cantera.reduaz.mx

Resumen

El estudio de las moléculas de superficie de cepas patógenas aviares de Escherichia coli (APEC) es muy importante para entender algunos de los eventos de la fisiopatología de la colisepticemia aviar. Sin embargo el medio ambiente, como nutrientes y temperatura, pueden afectar su expresión fenotípica. Tal es el caso de curli, cuya expresión puede o no variar entre los aislamientos y tipos clínicos de cepas. Con la finalidad de determinar si en un grupo de cepas APEC aisladas de colisepticemia,varía la expresión de curli en idénticas condiciones de cultivo, se probaron 6 clones de cada una de 29 cepas en el medio de cultivo YESCA a 26ºC. El 81.4% de las cepas tuvieron un comportamiento homogéneo (el total de los clones probados fueron positivos o negativos), mientras que el 20.7% restante mostraron variación entre los grupos de 6 clones probados. Estos hallazgos deberán tomarse en cuenta en los estudios que se realicen con curli.

Antecedentes

Escherichia coli patogénica es el agente causal de enfermedades intestinales y extraintestinales en humanos y animales que incluyen meningitis, bacteremia, diarrea, infección del tracto respiratorio y urinario. En aves, principalmente en pollos de engorda, son comunes la aerosaculitis, pneumonitis, colibacilosis septicémica o colisepticemia. Estas infecciones frecuentemente son secundarias a infecciones primarias causadas por virus y micoplasmas (1, 3, 6).

La transmisión de la colisepticemia es a través de la inhalación de polvo contaminado con heces fecales. La manera como se disemina al torrente circulatorio no esta clara, pero se ha sugerido que la unión a la traquea puede ser importante en la virulencia. Entre las moléculas de superficie que han analizado distintos investigadores para tratar de entender las interacciones huésped-microbio se encuentran unas proteínas de superficie de estructura fibrilar de aproximadamente 2 nm de diámetro, con un peso molecular entre 15-17 kDa denominadas curli, las cuales están constituidas por polímeros de una simple proteína llamada curlina que es codificada por los genes crl y csg (3, 6). Provence y Curtiss (6) analizaron la capacidad de aglutinar eritrocitos de pollo, la unión a la fibronectina y la expresión de curli en E. coli patogénica aviar, ya que las dos primeras características mencionadas se reconocen como importantes factores de virulencia en la adherencia a las superficies del huésped. Los tres fenotipos se expresaron en las cepas estudiadas y al parecer no requirieron de la expresión de crl, por lo que se consideró que este gen no fue esencial para estos fenotipos.

Se ha descrito que los genes crl participan en la formación de curli, mientras que el gen csgA codifica para la subunidad curlina principal. Se ha reportado que curli, no siempre participa en la unión a la fibronectina . El gen csgA se ha detectado en la mayoría de las cepas de E. coli aisladas de aves enfermas así como en las cepas comensales de aves sanas (1, 3, 6).

La expresión de curli en cepas aviares es influenciada por el medio ambiente, ya que es reprimida durante el crecimiento en presencia de altas temperaturas, alta osmolaridad y baja tensión de oxígeno, y en cambio se expresa a 26ºC en agar CFA o YESCA, en fase estacionaria, produciendo largos filamentos enrollados alrededor da la célula, mientras que en este mismo medio pero a 37ºC se ven como fibras individuales (5).

Curli puede mediar la internalización de E. coli septicémica aviar por células epiteliales in vitro lo que pudiera explicar en parte la capacidad de estas cepas para penetrar a sacos aéreos, torrente circulatorio y a órganos parenquimatosos (4) .

Las cepas de E. coli de humanos enterotoxigénicas, enterohemorrágicas y septicémicas así como otras enterobacterias como Salmonella typhimurium y S. Enteritidis también expresan curli o proteinas relacionadas con curli, con una diversidad a nivel de nucleótidos del 22% (7).

El nivel de expresión de curli varía considerablemente entre los distintos aislamientos y en los diferentes tipos clínicos de cepas. Por ejemplo, se ha reportado que entre un grupo de cepas llamadas EcoR, de diferentes fuentes naturales, el 20% expresaron curli a 26ºC y a 37ºC . Otras cepas silvestres expresan altos niveles de curli cuando se crecen en medios pobres y a temperaturas menores de 30ºC sugiriendo que la bacteria llaga al nuevo huésped con una alta densidad de curli. Muchas cepas enterotoxigénicas, enterohemorrágicas y septicémicas expresaron curli a 26ºC y retuvieron baja expresión de curli cuando crecieron a 37ºC in vitro. Los aislamientos enteroinvasivos y enteropatógenos no expresaron curli o expresaron poco a cualquier temperatura. Algunas cepas de Salmonella typhimurium expresan estas proteínas en altos niveles a 37ºC in vitro (5,7).

E. coli expresa mas curli en medio sólido que en líquido, lo que pudiera indicar una función adhesiva de curli (5).

La subunidad curlina purificada de E. coli puede unirse a diferentes proteínas humanas. Es interesante mencionar que estas proteínas tienen propiedades estructurales y funcionales no comunes que explican su afinidad por curli, sugiriendo que el polímero curli tiene la habilidad única de formar múltiples regiones de unión a proteínas con diferentes especificidades, de tal manera que la unión de una proteína dada a curli, no es bloqueada por la presencia simultanea de otras proteínas que interactúan con curli. Esta propuesta se fortalece por experimentos de inhibición en los que la unión a una proteína dada por curli, no inhibe su capacidad para unirse a otras proteínas. Esta remarcable habilidad de curli para interactuar específicamente con una variedad de proteínas del huésped y con superficies inertes le permite probablemente a E. coli adaptarse a diferentes nichos ecológicos (2, 5).

Se ha reportado la unión a laminina , a fibronectina y a plasminógeno así como las moléculas clase I del CMH. Se demostrado que en E. coli positivas a curli en plasma humano absorben el plasminógeno y el activador de plasminógeno tisular lo que conduce a la formación de plasmina activa proteolíticamente, lo cual puede promover la diseminación bacteriana a través de la degradación de los tejidos. Asimismo, en el plasma, curli puede inducir la liberación de bradicinina, un potente péptido proinflamatorio que produce vasodilatación, se incrementa la permeabilidad vascular, disminuye la presión sanguínea y hay diseminación de la infección (1, 3, 5, 6).

Otras propiedades que se han asociado a curli son la formación de biopelículas, que le permitirían a la bacteria evadir a los antibióticos y a los mecanismos de defensa inmunes, y, mas recientemente se ha propuesto que curli pudiera participar en los depósitos de placas amiloideas, similares a las de algunas neuropatías (2).

El presente trabajo se llevó a cabo para determinar los fenotipos de curli, bajo condiciones homogéneas en 29 cepas patógenas aviares, para su posterior análisis de su efecto en la patogenicidad.

Material y métodos

Se analizaron 29 cepas de Escherichia coli aisladas de igual número de casos de septicemia aviar.

Las bacterias se crecieron en un ml de caldo infusión cerebro corazón y se incubaron durante 18 a 24 horas a 37ºC, posteriormente se sembraron en agar tripticaseina soya por aislamiento en cultivo puro y se incubó toda la noche; posteriormente cada una de seis colonias seleccionadas al azar de cada cepa, se sembró por la técnica de estría continua en agar YESCA (para 1000ml de agua destilada:ácidos casamino10 g, extracto de levadura 1 g, bacto agar 20 g, rojo congo 20 mg, azul brillante G de Cumassie 10 mg ) y se incubó a 26ºC durante 48 horas para detectar curli. Los resultados se basan en el análisis visual de los medios YESCA. Un resultado positivo se da cuando la colonia bacteriana presenta una coloración rosada, violácea o roja (+, ++, +++). Se interpreta un resultado negativo, cuando la colonia presenta una coloración blanca (-).

Resultados

Los resultados se muestran en el cuadro 1.

Discusión

Aunque un 79.3% de las cepas mostraron un comportamiento fenotípico similar en los 6 clones probados por cepa, se encontró que en el 20.7% de las cepas restantes hubo variación fenotípica en la morfología colonial y/o en la expresión de curli dentro del grupo de los 6 clones probados por cepa /caso clínico, a pesar de que en todas las cepas se usaron las mismas condiciones de cultivo, por lo que estas características de variación se deben tomar en cuenta en estudios de frecuencia de curli en poblaciones bacterianas, asi como en estudio para elucidar la participación de curli en la fisiopatología de la colibacilosis aviar, incluyendo el nivel de expresión (+, ++, +++).
Por otro lado, los hallazgos en la variación fenotípica tanto en la morfología colonial como en la expresión de curli y su grado de expresión, podrían ser indicativos de que en la colibacilosis aviar puede participar mas de una cepa bacteriana, lo que explicaría en parte las grandes limitaciones que tienen las vacunas experimentales para la prevención de esta enfermedad.

Cuadro 1.- Fenotipos curli en 29 cepas patógenas aviares de E. coli.

*Los 6 clones probados por cepa dieron resultados homogéneos
**Variación fenotípica dentro del grupo de 6 clones por cepa por caso clínico.

g = colonia grande; ch = colonia chica

Literatura citada

1. Blanco, M., Blanco, J., Mora, A., Blanco, J.: Escherichia coli septicémicos aviares: serotipos, factores de virulencia, resistencia a antibióticos y desarrollo de vacunas. Med. Vet. 13:525-535. 1995.

2. Chapman, M., Robinson, L., Pinkner, J., Roth, R., Heuser, J., Amar, M., Normark, S., Hultgren, S.: Escherichia coli curli operons direct amyloid fiber formation. Science. 295 (5556): 851-855. 2002.

3. Dho-Moulin, M. And Fairbrother M.: Avian pathogenic Escherichia coli (APEC). Vet. Res.: 299-316. 1999.

4. Gophna, U., Barlev, M., Seijffers, R., Oelschlager, T., Hacker, J., and Ron, E.: Curli fibers mediate internalization of Escherichia coli by eukaryotic cells. Infect. Immun. 69 (4): 2659-2665. 2001.

5. Olsén A., Wick, M., Mörgelin M., and Björck.: Curli, fibrous surface proteins of Escherichia coli, interact with major histocompatibility complex class I molecules. Infect. Immun. 66 (3): 944-949. 1998.

6. Provence D., and CurtissIII, R.: Role of avian pathigenic Escherichia coli: a knockout mutation of crl does not affect hamagglutination activity, fibronectin binding, or curli production. Infect. Immun. 60 (11): 4460-4467. 1992.

7. Romling, U., Bian, Z., Amar, M., Sierralta, W., and Normark, S.: Curli fibers are highly conserved between Salmonella typhimurium and Escherichia coli with respect to operon structure and regulation. J. Bacteriol. 180 (3): 722-731. 1998.