Adherencia al colágeno tipo IV por cepas patógenas aviares de Escherichia coli.

Carlos Sánchez Villanueva, Rosa María Ramírez Santoyo, Federico de la Colina Flores, Yolanda Almanza Márquez.
Departamento de Enfermedades Infecciosas de la Unidad de Biología experimental de la Universidad Autónoma de Zacatecas. Calzada de la revolución Mexicana s/n, Col.tierra y libertad, Guadalupe, Zac., C.P. 98600. Tel. y Fax: (014)92-1-13-26.

Resumen:
En el presente estudio se analizó la capacidad de Escherichia coli aviar para adherirse al colágeno tipo IV, componente de la matriz extracelular, comparando cepas aisladas de casos clínicos de septicemia aviar, con cepas aisladas de aves clínicamente sanas.

Antecedentes:
La colibacilosis aviar es causada por cepas patógenas aviares de Escherichia coli (APEC, por sus siglas en inglés), que pueden coexistir con la flora indígena y diseminarse por contaminación fecal. Es un problema de salud y económico que afecta principalmente a la industria del pollo de engorda.

Los principales síndromes que causa APEC son los respiratorio y el septicémico, en los que juegan un papel clave diversos factores predisponentes como son los inherentes al manejo zootécnico de las aves como son la sobrepoblación, sed, hambre, exceso de vapores de amoniaco, mala ventilación, etc.; así como la participación de agentes patógenos primarios como micoplasmas, y virus que afectan vías respiratorias.

Existen diversos estudios tendientes a explicar la fisiopatología de la colibacilosis aviar, para proponer objetivamente medidas de control y prevención . Así, se ha propuesto que la principal vía de entrada de APEC es la aérea y que el primer sitio blanco de colonización es la traquea para su posterior diseminación a vías respiratorias bajas y/o al torrente sanguíneo.
En este trabajo se explora la posibilidad de que durante su recorrido, la bacteria se adhiera al colágeno tipo IV, componente de las proteínas de la matriz extracelular, al quedar ésta expuesta después de una lesión previa causada por otro microorganismo.

El colágeno tipo IV es un importante constituyente de la lámina basal de las células epiteliales, endoteliales y de glomérulo renal principalmente. La lámina basal es una matriz extracelular bien definida, que se presenta como una delgada capa flexible de 40 a 200nm de grosor, que delinea a los epitelios del conducto respiratorio y digestivo y al endotelio de los vasos sanguíneos entre otros. En algunos sitos como el alveolo pulmonar, la lámina basal se localiza entre dos capas celulares y funciona como un filtro altamente selectivo. Además de su función meramente estructural, puede determinar la polaridad celular, inducir diferenciación celular e influir en el metabolismo.
La constitución de la lámina basal depende de algunas moléculas de la matriz como el colágeno tipo IV que es la proteína estructural. Otros componentes son las proteínas adhesivas laminina y entactina, la primera tiene sitios de unión con el colágeno tipo IV, con glicosaminoglicanos y con receptores de la membrana plasmática, en tanto que la entactina, tiene como función unir a la laminina y al colágeno tipo IV.

Las moléculas de colágeno tipo IV tienen una estructura flexible, su triple hélice es interrumpida en 26 regiones, permitiendo la formación de múltiples uniones; estas moléculas interactúan por medio de su dominio terminal, para ensamblarse extracelularmente como una red flexible. Algunos estudios sugieren que dos moléculas de colágeno se asocian mediante su dominio carboxilo terminal para forman dímeros, los cuales posteriormente forman una extendida red de asociaciones por el extremo amino terminal, constituyendo, finalmente, redes insolubles bidimensionales.

La capacidad de algunos patógenos bacterianos para adherirse por medio de moléculas de superficie a componentes de la matriz extracelular como una estrategia de virulencia se ha explorado en los últimos años, denominándose a estas moléculas MSCRAMM siglas en inglés que significan componentes microbianos de superficie que reconocen moléculas adhesivas de la matriz, las cuales tienen tres características: a) se localizan en la superficie celular microbiana; b) reconocen un ligando macromolecular localizado exclusivamente en la matriz extracelular, como el colágeno o la laminina; c) la interacción MSCRAMM-componente de la matriz extracelular, debe ser de alta afinidad y especificidad .

Esta interacción parece ser importante para la fijación bacteriana a formas insolubles de proteínas de la matriz extracelular (MEC), que se encuentran en la superficie de las células epiteliales. Además de permitir la fijación de los patógenos a la MEC, esta unión puede también promover la adhesión de la bacteria a la célula huésped mediante un mecanismo puente, en el cual el patógeno se adhiere con la proteína de la MEC y esta a su vez interactúa con la célula eucariote mediante receptores de superficie. Existen 3 diferentes mecanismos por los cuales las bacterias pueden interactuar con el colágeno: 1- Reconocimiento, tanto de colágeno de triple hélice, como de colágeno desnaturalizado 2.- Reconocimiento a estructuras fibrilares y 3.- Interacción con el colágeno formador de redes, el cual contiene múltiples sitios de unión.

Varios reportes señalan que, diversos patógenos bacterianos tanto Gram positivos como Gram negativos, tienen la habilidad de unirse al colágeno.

La interacción de las cepas APEC con los componentes de la matriz extracelular, incluido el colágeno tipo IV como un mecanismo de patogenicidad ha sido poco estudiado, por lo que en el presente trabajo se realizó con la finalidad de explorar la posibilidad de que las cepas APEC tengan la capacidad de unirse al colágeno tipo IV, analizando dicha propiedad entre un grupo se cepas APEC, aisladas de órganos parenquimatosos de pollos con colisepticemia aviar y un grupo de cepas de E. coli aisladas de cloacas de pollos de engorda clínicamente sanos,

Material y Métodos:

Microrganismos.- A partir de 80 cepas de E.coli, aisladas de aves clínicamente sanas, se seleccionaron 5 de estas ColV negativas y fimbria tipo 1 negativa; ya que los fenotipos ColV y fimbria tipo1 están asociados a la patogenicidad además se utilizaron 6 cepas de E.coli aisladas de casos clínicos de septicemia aviar identificadas como YA4, YA11, YA21 YA26, EI35 y 3677 las cuales previamente han sido caracterizadas en función de algunos mecanismos de patogeniciadad. Para la detección de la colicina V se utilizaron, como cepas indicadoras, E.coli K12 711 sensible a todas las colicinas y su isogénica K12 711 mutante resistente a la colicina V. Para la detección de la fimbria tipo 1 se utilizó Candida albicans y para la prueba de oxidasa Pseudomonas aeruginosa, como control positivo. A excepción de las 5 cepas de aves sanas, las demás bacterias fueron obtenidas del cepario del Departamento de Enfermedades Infecciosas de la Unidad de Biología Experimental de la UAZ.

Obtención de muestras de aves clínicamente sanas.- A 25 pollos de engorda de 7 semanas de edad se les tomaron muestras cloacales con hisopos estériles, se identificaron numéricamente y se transportaron al laboratorio en medio Stuart en refrigeración.

Medios de cultivo e identificación de cepas de E.coli de aves clínicamente sanas.- Cada una de las muestras fue sembrada por la técnica de aislamiento de cultivo puro, en Agar de MacConkey, y se incubó 18 h. a 37°C.; posteriormente de cada caja sembrada, se aislaron de 4 a 6 colonias coliformes a las cuales se les realizó la identificación bioquímica de acuerdo a la metodología recomendada por Carter. Las cepas de E.coli se guardaron en viales conteniendo medio para preservar E.coli (Caldo nutritivo 10 g, NaCl 5g, Agar 6g en 1L de agua). A la identificación numérica original se agrego un segundo número que indica la cepa aislada de cada pollo. A estas cepas se les determinó la producción de colicina V y la expresión de F1.

Detección de colicina V.- Se hizo la prueba de colicinogenia de acuerdo a la técnica descrita por López Alvarez (19): Se sembraron las cepas en 1 ml de caldo nutritivo (CN) y se incubaron a 37°C por 18 h; posteriormente, de cada tubo se tomó una asada y se sembró en Agar de MacConkey por la técnica de aislamiento en cultivo puro y después de incubar por 18 h a 37°C, se seleccionaron 10 colonias aisladas que se clonaron por triplicado en dos placas con medio Agar Extracto de Levadura-triptona-calcio (10g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl, 0.555g de CaCl, 1% de agar en 1000ml de agua) (LTC) y una con Agar de MacConkey, se incubó por 18 horas.

Los cultivos de las placas de LTC se inactivaron con vapores de cloroformo durante 15 minutos y después se airearon por 15 minutos. A cada uno de estos, se les vertió una sobrecapa de 4.5 ml de LTC semisólido (0.6%) licuado que contenía 0.1ml de cada una de las cepas indicadoras (E. coli K12 711 sensible a todas las colicinas y su isogénica mutante resistente a la colicina V) las cuales habían sido crecidas previamente en CN a 37°C por 18 h.

Una vez solidificada la sobrecapa, se invirtieron e incubaron a 37°C por 18 h. Los halos de inhibición de crecimiento de la cepa 711 fueron indicadores de colicinogenia, en tanto que la no inhibición de crecimiento de la cepa 711 mutante resistente a la colicina V, indicó que la colicina producida fue del tipo V.

Detección de la fimbria tipo 1.- Se realizó de acuerdo a la técnica de aglutinación con Candida albicans descrita por May (22): Cada cepa se inoculó en 5 tubos, cada uno conteniendo 5 ml de caldo Luria (LB) y se incubó a 37°C, en condiciones estáticas por 72 h. Las bacterias se cosecharon por centrifugación a 3500 rpm/min durante 10 minutos a 4°C y se lavaron dos veces con solución salina fisiológica (SSF).

Posteriormente se ajustó la suspensión bacteriana a una absorbancia de 2.6 (DO620nm,)para obtener una población mínima de 1x109 a 1x1010 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml. Paralelamente se creció Candida albicans en medio Agar-Dextrosa de Sabouraud y se ajustó a una población de 1x108 UFC por ml. Posteriormente se inactivaron por exposición a vapores de cloroformo.

Una suspensión de 50 ml de Candida albicans se mezcló con 50 ml de la suspensión de E.coli en una placa de vidrio y después de un minuto se hizo la lectura. En caso de aglutinación positiva, se repitió la prueba, utilizando una suspensión de Candida albicans con 5% de manosa para corroborar que la fimbria aglutinante fuera tipo 1.

Selección de cepas.- Cinco cepas aisladas de aves clínicamente sanas las cuales no expresaron fenotípicamente la colicina V ni la fimbria tipo 1 fueron seleccionadas para el resto de los experimentos.

Curva de crecimiento bajo condiciones estáticas. Con la finalidad de determinar el tiempo en el cual las bacterias alcanzan la fase de crecimiento logarítmico para en los experimentos subsecuentes obtener células en la mitad de esta fase se realizó este ensayo.
La cepa de APEC YA21 y la cepa indígena CA1 se inocularon por separado en 1ml de CICC y se incubaron a 41°C durante 24 horas. Posteriormente, se tomó 0.1 ml de cada cultivo y se incubó en 70 ml de CICC tomando ésta como hora cero, se hizo la primer lectura en espectrofotómetro a 620 nm, el resto del cultivo se incubó a 41°C en condiciones estáticas. Las siguientes lecturas se hicieron cada hora, manteniendo el resto del cultivo bajo las condiciones ya descritas, finalizando hasta que se obtuvieron 3 lecturas iguales, lo que es indicativo de fase de crecimiento estacionario.

Ensayo de adherencia al colágeno tipo IV.- Se realizaron en cajas de 24 pozos (Corning) que contenían cubre-objetos de 12 mm de diámetro con colágeno y sin colágeno. El colágeno tipo IV (Sigma) se preparó de acuerdo a las indicaciones del manufacturador a una concentración de 8 mg/cm 2 y se incubaron a 4° C hasta que se secaron, un promedio de 72 horas. Cada una de las cepas a probar se inocularon en 1 ml de CICC y se incubaron 18 h. Posteriormente 100 ml de este cultivó, se inocularon en un matraz de 70 ml de CICC y se incubaron por 5 h a 41°C (mitad de fase de crecimiento logarítmico). Las bacterias se concentraron por centrifugación a 10 000 rpm durante 10 min a 4° C. y se lavaron dos veces con PBS-gel. El inóculo se ajustó por espectrofotometría a 1.5 de absorbancia (DO620nm,) lo que equivale a una población bacteriana de 109 UFC/ml. Se ajustó el inóculo a 107 UFC/ml y de esta suspensión se colocaron 0.5 ml sobre cada cubreobjetos cubierto con colágeno, así como en los cubreobjetos libres de colágeno. Se incubaron 90 minutos a 37°C 5% de CO2 y 85% de humedad relativa, posteriormente se lavaron 3 veces con PBS utilizando bomba de vacío, se fijaron con solución de Bowin durante 10 min; se lavaron tres veces con agua destilada y se agregó metanol absoluto por 15 min y se tiñeron con Giemsa durante 45 minutos, después de enjuagarlos con agua se secaron y montaron en un portaobjetos con resina sintética. El mismo procedimiento se siguió con los cubreobjetos libres de colágeno. Finalmente se observó al microscopio contando diez campos visuales al azar en cada cubreobjeto. El ensayo se repitió dos veces.

Análisis estadístico.-
Diseño experimental: Se uso un diseño anidado de tres fases con dos variables clasificatorias, donde una es la cepa y la otra es la adherencia. La primera fase es el tratamiento (la adherencia), la segunda es la réplica (dos réplicas) y la tercera es los campos visuales observados al microscopio (diez) de acuerdo al siguiente modelo:

Yijklm=U+aI +Bjk+Yk+(aB)ij+(ay)ik+(By)jk+C(ijk)l

m media en las condiciones experimentales

ai efecto de la inésima cepa

bj efecto de la j ésima base de adherencia

yk efecto de la k-ésima placa

(aB)ij, (ay)ik y (By)jk son las interacciones.

C(ijk)l son los campos observados en el microscopio dentro de cada placa, dentro de las combinaciones de cepa por base de adherencia.

Los datos se transformaron en logaritmos para su análisis. Para el procesamiento de datos se utilizó el paquete estadístico SAS versión 6.1

RESULTADOS
Cepas de E.coli de aves clínicamente sanas. Se aislaron 80 cepas de
E.coli a partir de 20 pollos de engorda de 7 semanas de edad clínicamente
sanas.

Detección de colicina V.- Los resultados se describen en el cuadro No.1.

Cuadro 1. Expresión fenotípica de colicinas en 80 cepas de E. coli aisladas de aves
clínicamente sanas.

Detección de fimbria tipo 1.- Del total de 39 cepas que no expresaron colicina V, esto es, a 10 cepas no colicinogenicas y a 29 que expresaron sólo colicinas diferentes a la V, se les determinó la presencia de F1, encontrandose que únicamente 5 de ellas (12.82%) carecían de esta estructura.

Selección de cepas de E. coli indígenas para ensayos de adherencia.- De un total de 80 cepas, únicamente no expresaron colicina V, ni la fimbria tipo 1; siendo estas identificadas como CA1, CA2, CA3, CA4, y CA5, el origen de estas cinco cepas fueron solo de dos pollos. (Cuadro 2).

Cuadro 2. E. coli aisladas de aves clínicamente sanas
que no expresaron Col V ni F1.

Curva de crecimiento bacteriano: La mitad de la fase de crecimiento logarítmico se alcanzó a las 5 horas, bajo las condiciones de incubación descritas, por lo que para los ensayos de adherencia las bacterias se crecieron durante este lapso de tiempo.

Adherencia al colágeno tipo IV.

De acuerdo a la metodología descrita, se encontró que de las seis cepas de E. coli patógenas aviares probadas, cuatro de estas mostraron una alta adherencia al colágeno tipo IV, en contraste, de las cinco cepas de E. coli de flora indígena, solo una mostró adherencia a este componente de la matriz extracelular (Cuadro 3 y Figura 1).

Cuando se midió la adherencia de las cepas patógenas al colágeno tipo IV y se comparó con la adherencia al vidrio se encontró que tres cepas se adhieren más al colágeno tipo IV, una de las cepas se une más al vidrio, mientras que en dos de las cepas no se encontró diferencias significativas en la adherencia a estas superficies. Por su parte, de las cinco cepas de E. coli de flora indígena en cuatro de estas no hubo diferencia en la adherencia al colágeno y al vidrio, sin embargo esta adherencia fue baja (Cuadro3 y Figura 1).

Cuando se midió la adherencia por grupos de cepas patógenas y de flora normal se encontró que las bacterias patógenas se adhieren más al colágeno tipo IV y al vidrio que las cepas de flora indígena (Cuadro 5 y Figura 2).

Cuadro 3. Adherencia al colágeno tipo IV por
cepas de E. coli

Cepa	Adherencia al colágeno IV	Adherencia al vidrio
YA26	201.1a	81.6b
3677	188.3a	65.6b
YA11	78.6a	29.8b
YA21	181.4b	281.5ª
EI35	99.1a	130.5a
YA4	12.4a	17.6ª
CA1	41.2a	15.8ª
CA2	97.8a	23.0b
CA3	18.1a	38.2ª

CA4	51.2a	70.3ª
CA5	44.2a	17.9a
GENERAL	91.1ª	70.2b

Promedios con superíndice literal diferente
denotan diferencia estadísticamente significativa

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Figura 1.- Adherencia de cepas aviares de E. coli al colágeno IV y al vidrio. 1 a 5
cepas patógenas, 7 a 11 cepas indígenas.

Cuadro 4 Análisis de varianza para el diseño experimental de este ensayo.

Fuente de	Grados de	Suma de	Cuadrados
Variación	libertad	Cuadrados	Medios	f
Modelo	43	4664519	108477.18	24.62
Error	396	1745035	4406.6535
Total corregido	439	6409553
Cepa	10	1739044	173904.4	39.46
Colágeno	1	52932.4	52932.4	12.01
CepaXcolágeno	10	451486	45148.55	10.25
Día/CepaXcolágeno	22	2421057	110048.04	24.97
r2 =	0.728
CV % =	81.9

Cuadro 5.- Promedio de adherencia al colágeno tipo IV
y al vidrio.

Adherencia

Tipo de cepa	Colágeno tipo IV	Vidrio
Flora normal	50.5a	33.0a
Patógena	126.8a	101.1b
General	88.6a	67.1b

Superíndice diferente denota diferencias estadísticamente
significativa

Figura 2.- Promedio de adherencia al colágeno tipo IV
y la vidrio por cepas de E. coli patógena y de flora indígena

DISCUSIÓN
E.coli patógena aviar es considerada una bacteria oportunista que bajo condiciones de estrés de las aves es capaz de causar enfermedad; los hallazgos en este trabajo sobre la frecuencia de la colicina V y la fimbria tipo 1 en E.coli indígena aviar, demuestran que un alto porcentaje de las cepas aisladas de aves clínicamente sanas portan estos factores asociados a la patogenicidad, por lo que se demostró el gran reservorio de estas cepas que constituye el contenido intestinal.

Llama la atención que de las 39 cepas de E. coli que no expresaron colicina V, únicamente 5 no expresaron F1 en este ensayo, el papel de F1 en la patogenicidad es controversial, ya que ésta ha sido reportada también en cepas no patógenas, mas aun, en el Departamento de Enfermedades Infecciosas, la cepa avirulenta, de laboratorio, E.coli K12-711 expresó esta estructura.

En el presente trabajo, bajo las condiciones descritas, se encontró que la mayoría de las cepas patógenas aviares se unieron fuertemente al colágeno IV en comparación con las cepas de E. coli aisladas de pollos clínicamente sanos; estos hallazgos nos sugieren que la adherencia al colágeno tipo IV es una característica de patogenicidad, sería interesante analizar que componentes bacterianos pudieran interactuar en esta unión.

En los tejidos normales, la matriz extracelular, está rodeando células epiteliales o endoteliales, y por lo tanto estas no están disponibles para la unión bacteriana. Sin embargo, cualquier tipo de trauma que dañe los tejidos del huésped, puede exponer las proteínas de la matriz extracelular, permitiendo así la colonización microbiana y la infección (39).

Blanco (2) refiere que González et al comprobaron que E. coli septicémica aviar, se une a la fibronectina y al colágeno tipo II, probablemente como consecuencia de una infección inicial por un micoplasma o un virus, donde el epitelio de la tráquea quedaría dañado y la fibronectina al descubierto, por lo que pudiera servir de receptora a las bacterias. Así mismo Van Den Bosh et al (45) sugirieron, en la discusión de su trabajo, que las fimbrias P aviares, podrían estar especialmente equipadas para adherirse a los sacos aéreos y a otras membranas serosas y que tal adhesión podría ser al colágeno o a la fibronectina.

La identificación y caracterización de componentes bacterianos que median la adhesión a las células huésped y a la MEC, es indispensable para entender los aspectos moleculares de la patogénesis y dada la emergencia de bacterias multidrogas-resistentes, estos conocimientos pueden conducir a proponer nuevas alternativas de la terapia antimicrobiana.

En las cepas patógenas que se adhirieron al colágeno tipo IV, será interesante dilucidar que moléculas de superficie bacteriana participan en la interacción con este componente de la MEC.

Diversas moléculas de superficie bacteriana, tales como fimbria FI, curli, P y proteínas de membrana externa, entre otras, han sido propuestas como adhesinas para diversos receptores del huésped; también se ha encontrado en algunos de estos estudios, que la expresión de las adhesinas es dependiente del medio ambiente, por lo que sería interesante, en un futuro, analizar si la adherencia al colágeno cambia si se modifican las condiciones de cultivo.

Al comparar la capacidad de cada cepa estudiada, para adherirse al colágeno tipo IV y al vidrio, se encontró que en una de las 6 cepas patógenas hubo una mayor adherencia al vidrio que al colágeno, lo que conduciría a investigar si las adhesinas para estas dos superficies son diferentes e independientes.

CONCLUSIONES.
Las cepas patógenas de E. coli aviar se adhieren más al colágeno tipo IV que las cepas de flora indígena, lo que sugiere que este sea un mecanismo de patogenicidad.

En nuestro modelo de estudio, cada cepa bacteriana se probó ante vidrio y ante colágeno, corroborándose que las cepas patógenas aviares, tienen una mayor capacidad de adherencia al vidrio que las cepas no patógenas.

Los resultados de este trabajo demuestran la importancia de caracterizar cepas aviares de E.coli de flora normal en función de atributos de virulencia descritos tanto para utilizarlas en estudios comparativos con cepas patógenas, como para el entendimiento evolutivo de E. coli.

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