Proteínas de membrana externa en cepas patógenas aviares de Escherichia coli adherentes al colágeno tipo IV.

Luz Elena Vidales Rodríguez, Laura Libier Salazar Serrano, Rosa María Ramírez Santoyo*, Yolanda Almanza Márquez*.
Departamento de Enfermedades Infecciosas de la Unidad Académica de Biología Experimental de la Universidad Autónoma de Zacatecas. Calzada de la revolución mexicana s/n Col. Tierra y Libertad. Guadalupe, Zacatecas, C.P. 98600, Tel. y Fax: (014)92-1-13-26. *Correspondencia: E-mail: colv21@hotmail.com y romaras@hotmail.com

Resumen: Las proteínas de membrana externa (Omp) de las bacterias patógenas Gram negativas además de participar en el transporte y como receptoras de fagos y colicinas, también pueden desempeñar junto con otros factores de virulencia un papel importante en la patogenicidad. En el presente trabajo se estudiaron los patrones electroforéticos con PAGE-SDS y Western blot de las Omp de cepas de Escherichia coli aviares patógenas y de flora indígena adherentes y no adherentes al colágeno tipo IV. En las cepas adherentes, 3 de ellas patógenas y una de flora indígena, sólo en las patógenas se detectó una banda de peso aproximado de 92 kDa, lo que es indicativo de que se requiere de características adicionales presentes en las cepas patógenas, pero no en las indígenas. Por otro lado, dentro del grupo de cepas no adherentes probadas, se usaron dos cepas APEC y la cepa del laboratorio K12 711, así como las cepas indígenas CA2 y CA5, ninguna presentó la banda mencionada. Estos hallazgos nos permiten proponer que la Omp de peso aproximado de 92 kDa está asociada a la capacidad de adherencia al colágeno tipo IV de las cepas APEC. También se detectó una banda de peso aproximado de 39 kDa únicamente en las cepas patógenas.

Antecedentes

La membrana externa es un componente importante de la pared celular de las bacterias Gram negativas. Se encuentra externamente al peptidoglicano y está constituida principalmente por fosfolípidos, lipoproteína mureina llamada de Braun, lipopolisacárido (LPS) y proteínas a las que se les denomina proteínas de membrana externa (Omp).

Las Omp han sido ampliamente estudiadas para entender su papel en la estructura y función de la célula bacteriana. Aproximadamente el 50% de la masa seca de la membrana externa de las bacterias Gram negativas son proteínas (1, 2).

En la bicapa de fosfolípidos de la membrana externa flotan más de 100,000 canales proteínicos individuales. que se clasifican en tres grandes grupos (1, 2):

1.- Las porinas, llamadas también proteínas de matriz o proteínas principales de membrana por ser las mas abundantes (en términos de masa, ellas representan hasta el 2% del total de las proteínas de la célula), forman canales de gran tamaño que permiten la difusión pasiva de iones y moléculas hidrofílicas = 600 daltons a través de la membrana. Las porinas mas conocidas de E. coli son el trímero PhoE (38,782 Da), OmpF (38,306 Da) y OmpC (37,683); cada subunidad produce un canal, por lo que el trímero tiene tres canales. La proteína PhoE se expresa únicamente en condiciones de estarvación de fosfato . En medio de cultivo usual solamente la OmpF y la OmpC se producen .
Cuando el complejo péptidoglicano-membrana externa se extraen con SDS a temperaturas inferiores a 60ºC, la mayoría de las proteínas se rezagan en la fracción insoluble. Las porinas pueden ser solubilizadas con sus trímeros fuertemente asociados incluyendo 1M NaCl en la solución de SDS. Se requiere calentar en SDS a una temperatura superior a los 70ºC para desnaturalizar a las porinas y disociarlas en subunidades monómericas.

Cuando E. coli se encuentra en el aparato digestivo, a 37ºC y en ambiente de osmolaridad alta, sintetíza sobre todo OmpC (la porina mas pequeña). Se cree que la OmpC protege a la bacteria de los efectos tóxicos de las sales biliares, pero permiten que los nutrientes penetren en la célula. Cuando E. coli se encuentra en el agua, donde se desarrolla a temperaturas inferiores, en un ambiente de baja osmolaridad y y con escasez de nutrientes, sintetíza sobre todo OmpF.

2.- Las proteínas similares a las porinas, la mas estudiada es la Lamß, que es receptora del fago lambda y que facilita la difusión pasiva específica de la maltosa y otros solutos pequeños.

3.-Receptores Ton dependientes, son porinas inducibles en pequeñas cantidades que se caracterizan porque los receptores están enlazados a una proteína dependiente de energía llamada TonB localizada en la membrana citoplasmática.. Los receptores TonB se enlazan con moléculas de gran tamaño y escasas como la vitamina B12 y los complejos quelantes de Fe+ facilitando su desplazamiento hacia el periplasma.

Algunas cepas de E. coli producen porinas alternativas o adicionales como la proteína 2 o Lc, codificada por un profago. Las cepas encapsuladas de E. coli frecuentemente producen una porina característica, la proteína K (184,210). Algunos ejemplos de Omp asociadas a transporte específico se muestran en el cuadro 1 (1, 2).

Otras proteína muy estudiada de la membrana externa es la OmpA (35,159), monómero cuya función está asociada a la integridad estructural y forma de la célula. Puede ser extraída por SDS a baja temperatura, sin embargo, su movilidad en PAGE-SDS disminuye a 100ºC por su desnaturalización, por lo que se conoce como “modificable al calor”. Hay aproximadamente 105 moléculas de OmpA per célula; es receptora de fagos y de pelo sexual y está involucrada en la captación de aminoácidos y péptidos (1, 2).

Prácticamente todas las proteínas de membrana externa son hidrofílicas y tienen una estructura de barriles ß una vez que han sido completamente ensambladas, requisito para que pasen del espacio periplásmico a su lugar en la membrana externa. Esta es una diferencia marcada con las proteínas de la membrana citoplasmática, la mayoría de conformación a hélices que pueden insertarse sucesivamente de una por una (2).

Las Omp en la patogenicidad

La estructura y función de las Omp están siendo ampliamente estudiadas y en años recientes se han relacionado algunas de estas proteínas con los mecanismos de patogenicidad bacteriana. Asi, las proteínas OmpC y Omp F de E. coli pueden actuar como modulinas al estimular la síntesis de citosinas (3, 4).

Algunas proteínas se pueden asociar al lípido A (LAP) del LPS y tener actividades biológicas diferentes del LPS sólo. El complejo LAP es muy estable, ya que al calentarlo a 100ºC durante 30 minutos y someterlo a tripsina durante dos horas, no se disminuye su actividad biológica. El efecto modulador o simulador de citocinas varía según la especie bacteriana, en E. coli pueden inducir la formación de colonias de granulocitos/macrófagos y este efecto puede ser bloqueado por neutralización con antisuero anti-IL-1 ß. La proteína activa en la preparación LAP tiene una masa molecular de 17 kDa (3, 4).

Los pesos moleculares se calcularon de las secuencias nucleotídicas.
Los valores con asteriscos son el peso molecular aparente, deducido de la
movilidad en PAGE-SDS.

La expresión de Omp25 de Brucella suis, una bacteria intracelular facultativa, inhibe la producción de FNT-a durante su infección a macrófagos, como una estrategia para sobrevivir y multiplicarse intracelularmente en el huésped . El FNT-a es una citocina pro-inflamatoria que estimula a las células presentadoras de antígeno y participa en la iniciación de la respuesta inmune (5).

E. coli es la bacteria Gram negativa más común de casos de meningitis neonatal en humanos, su principal vía de entrada es la hematógena, aunque no está claro su neurotropismo el principal blanco de estas cepas son las células endoteliales de la
microvascularización cerebral (no así en las células endoteliales sistémicas). La expresión de OmpA y de Ibe 10 son necesarias para la invasión bacteriana y para inducir la acumulación de actina, probablemente mediante la activación de señales de transducción. La OmpA se une a epítopes GlcNAc ß1-4GlcNAc de las glicoproteínas de las células endoteliales de la microvascularización, disparando señales para la polimerización de la actina. (nov 99). OmpA también participa en la resistencia a la acción bactericida del suero (6-9).

La interacción entre las bacterias patógenas y sus productos con los tejidos o proteínas solubles del huésped es crucial durante las enfermedades infecciosas. Una gran variedad de bacterias se pueden unir a proteína del huésped, en especial a proteínas de la matriz extracelular como el colágeno, la laminina y la fibronectina. La proteína YadA de Yersinia está asociada a diversas funciones de virulencia como son la resistencia a la acción lítica del complemento, resistencia a la fagocitosis, adherencia a células mamíferas y más recientemente se ha demostrado que media la unión específica a los colágenos tipo I, II, III, IV, V y IX así como a la fibronectina celular. Esta interacción podría ser la adhesión inicial a la membrana basal del huésped. (10, 11). Efectos similares producidos por la Omp YopE de Yersinia pseudotuberculosis se han reportado (12).

Se ha propuesto que la proteína EspD de E. coli enterohemorrágica participa en el ensamble de un apéndice que le permite a las bacterias adherirse a la célula blanco y participa en la traslocación de moléculas efectoras mediante el sistema de secreción III (13)

Moléculas de superficie asociadas a la patogenicidad de E. coli aviar

En el estudio de la patogenicidad bacteriana de la enfermedad respiratoria y la colisepticemia causadas por cepas patógenas aviares de E. coli (APEC), es de gran interés detectar las moléculas de superficie que pudieran actuar como mediadoras en la adherencia a los tejidos o proteínas solubles del huésped, dado que la adherencia y colonización son el primer paso para que se presente la enfermedad.

Aunque en E. coli se han detectado 171 antígenos de superficie somáticos “O” (constituyentes del LPS), 103 antígenos capsulares “K” y más de 56 antígenos flagelares “H”, apenas algunos serotipos y serogrupos se presentan en las cepas APEC, y su papel en la patogenicidad parece ser más importante durante la diseminación de la bacteria en el huésped, ya que se han asociado a las resistencias al complemento y a la fagocitosis.

Otras proteínas de superficie cuya participación en la patogenicidad de las cepas APEC llaman la atención son los apéndices fimbriales Tipo 1, curli y P, así como la proteína Tsh, hemoaglutinina sensible al calor, cuya fracción de 33 kDa se queda anclada transmembranalmente, mientras que la fracción de 106 kDa es secretada (14-17).

El papel de la fimbria tipo 1 en la adherencia al epitelio traqueal es controversial, pero no se descarta que esta fimbria pudiera participar en la colonización de los pulmones. Aunque se reporta que es muy frecuente en cepas APEC, nosotros encontramos que también es muy frecuente en cepas de E. coli de pollos sanos (18).Las adhesinas fimbriales P se han detectado en algunas cepas APEC y se ha correlacionado con algunos serogrupos y serotipos, así, Van den Bosh et al encontraron que el 92% de 203 aislamientos de E. coli de pollos con septicemia expresaron esta fimbria cuando los serotipos fueron O1:K1, O2:K1 y O78:K80. Fuertes evidencias sugieren que las cepas expresan esta fimbria al colonizar pulmones pero no al colonizar traquea . La participación de curli en procesos patogénicos no es claro, pero se ha propuesto que estas estructuras filamentosas median la unión bacteriana a proteínas de la matriz extracelular y a proteínas del suero como a la fibronectina, laminina, plasminógeno y proteína activadora del plasminógeno. Algunos investigadores han reportado que el gen csgA que codifica para la subunidad principal de curli se encuentra tanto en cepas de E. coli aislada de aves enfermas como de E. coli comensal aislada de pollos sanos. En cambio, llama la atención que Tsh, se detecta frecuentemente en cepas APEC, pero no en E. coli de aves clínicamente sanas. Se ha propuesto que el gen tsh se encuentra localizado en el plásmido relacionado con la virulencia ColV. Tsh se ha asociado con la resistencia a la acción bactericida del suero y con lesiones en sacos aéreos (14-17).

Aún cuando existe cierta uniformidad en los serogrupos que causan colisepticémia, los estudios de polimorfismo en las proteínas de membrana externa, fimbria y enzimas metabólicas revelan una variación genética sustancial. En los estudios de los patrones de las Omp de cepas APEC se han encontrado divergencias entre varios autores, por lo que proponen que probablemente se debe a que usaron diferentes condiciones de cultivo y procedimientos para su aislamiento. Aunque algunas Omp como la OmpA se ha demostrado que participa en la virulencia, la contribución de la variación entre las otras Omp para diferencias en la virulencia y en la patogénesis de la colisepticemia aviar se desconoce (19).

Recientemente en nuestro laboratorio se encontró que de 6 cepas APEC aisladas de septicemia, 4 mostraron una alta adherencia al colágeno tipo IV, en contraste, de las cinco cepas de E. coli de la flora indígena sólo una mostró adherencia significativa a este componente de la matriz extracelular (19). Con la finalidad de determinar si había diferencias entre los patrones electroforéticos con PAGE-SDS y Western blot de las Omp de cepas de Escherichia coli aviares patógenas y de flora indígena adherentes y no adherentes al colágeno tipo IV se realizó el presente trabajo.

Material y Métodos:

Cuadro 2.- Calendario de inmunización a conejos N.Z. para obtener anticuerpos Policlonales anti-Omp.La fuente de Omp fue la cepa YA21 adherente al colágeno. ACF = Adyuvante completo de Freund;
SC = Subcutáneo; IM = intramuscular.

Microorganismos: Se utilizaron 4 cepas de E. coli que de acuerdo a estudios previos presentaron adherencia positiva al colágeno tipo IV: YA26, EI35, CA4,YA2114; y 3 cepas de E. coli que presentaron adherencia negativa al colágeno tipo IV: YA4, K12-711 y YA2106. Para ensayos comparativos entre bacterias patógenas y de flora normal se utilizaron además las cepas:CA2,CA3 y CA5 aisladas de aves clínicamente sanas (18).

Obtención de Proteínas de Membrana Externa (Omp): Las bacterias se crecieron en 5 ml de caldo infusión cerebro corazón (CICC) a 37°C toda la noche, en condiciones estáticas. El cultivo bacteriano se concentró por centrifugación a 10,000 rpm y se lavó dos
veces con Na2HPO4 10mM pH 7.2, el paquete celular mantenido en cama de hielo fue sonicado por pulsos de 30 segundos hasta que la muestra se clarificó; la cual se centrifugó por 2 minutos a 12000 rpm a 4°C; se separó el sobrenadante en el cual están contenidos los fragmentos de membrana externa y nuevamente se centrifugó por 30 minutos a 12000 rpm a 4°C, el botón obtenido se resuspendió en Na2HPO4 10 mM pH 7.2/tritón X-100 al 2% y enseguida se incubó por media hora a 37°C y centrifugó nuevamente por media hora a 4°C y 12000 rpm, pasado este tiempo se realizó un lavado con Na2HPO4 10mM pH 7.2 para finalmente resuspender las proteínas obtenidas en PBS pH 7.4. Se le adicionó PMSF 0.2mM como inhibidor de proteasas y se congeló hasta su uso.

Producción de anticuerpos anti-Omp: Se utilizaron conejos machos Nueva Zelanda de 6 meses de edad. El calendario de inmunización se describe en el cuadro 2.

Descomplementación y adsorción de suero hiperinmune anti-Omp: El suero hiperinmune fue descomplementado a 56ºC durante 30 min.
Para la adsorción del suero hiperimune anti-Omp contra la fimbria tipo 1, se utilizó la cepa YA11 de E. coli que por ensayos de aglutinación con Candida albicans ha mostrado ser positiva para la expresión de esta estructura (20). Se cultivó la cepa YA11 en 50 ml de caldo infusión cerebro corazón (CICC) en condiciones estáticas a 37ºC; las bacterias se concentraron mediante centrifugación a 3000 rpm a 4ºC por 10 minutos y el paquete bacteriano se lavó dos veces con PBS; posteriormente se ajustó D.O.620nm hasta 1.5 de absorbancia con PBS-gel para obtener una cantidad de bacterias de 109 UFC/ml y se hicieron diluciones decimales en PBS hasta 10-2 en la cual se obtiene una población bacteriana de 107 UFC/ml. Esta suspensión bacteriana se mezcló 1:1 (vol/vol) con el suero de conejo hiperinmune descomplementado y se sometió a incubación a temperatura ambiente con oscilación suave por 15 minutos; enseguida se centrifugó a 10000 rpm a 4°C por 10 minutos y se recuperó el sobrenadante.
El suero hiperinmune fue sometido a una segunda absorción contra las proteínas de membrana externa de la cepa YA21-6 de E. coli que previamente a mostrado negativa a la adherencia al colágeno tipo IV. El suero se mezcló con las Omp obtenidas de la manera ya descrita de la cepa YA21-6 durante 15 minutos a temperatura ambiente y en oscilación suave, posteriormente se centrifugó y se filtró (poro de 0.45mm) y se congeló hasta su uso.

PAGE- SDS y electrotransferencia (21): Las Omp se sometieron a una electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones reductoras (). Se utilizó un gel separador de gradientes de 8% y 18% de acrilamida y un gel concentrador de 4%. Para los ensayos comparativos entre cepas adherentes y no adherentes al colágeno tipo IV se corrieron 35ml de Omp de las cepas adherencia positiva: YA26, EI35, CA4 y YA21-14; y 70ml de las cepas adherencia negativa: YA4, K12-711 y YA21-6; por carril, en tanto que para los ensayos comparativos entre el grupo de cepas patógenas: YA26, EI35 y YA21-14; y el de cepas aisladas de aves clínicamente sanas: CA2, CA4, CA5 y CA1 se corrieron 35ml de Omp por carril. Como estandar de peso molecular se utilizaron: miosina (200 kDa), b-galactosidasa (116 kDa), fosforilasa B (97 kDa), ASB (66.2 kDa), ovolbumina (45 kDa), anhidrasa (31 kDa), inhibidor de la tripsina (21.5 kDa Bio-Rad). La electroforésis se corrió a 150 volts por aproximadamente 8 horas
Al terminar el corrimiento uno de los geles fue teñido con azul de Coomassie R-250 y a partir de los geles no teñidos las proteínas fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa, utilizando una cámara de sistema semi-seco (Bio-Rad) a 15 volts durante 15 minutos a temperatura ambiente; al término de la transferencia las bandas fueron reveladas con el colorante verde rápido, luego fueron lavadas con agua destilada.

Western Blot (21):. La membrana de nitrocelulosa se bloqueó en PBS-leche al 3% toda la noche, posteriormente se le realizaron dos lavados con PBS-Tween 20 al 0.5% seguido de tres lavados con PBS, luego se incubó con el suero hiperinmune descomplementado y adsorbido a una dilución 1:200 en PBS leche al 3% por 1 hora en agitación suave, pasado este tiempo se realizaron nuevamente tres lavados con PBS-leche 3%, dos lavados con PBS-Tween 20 al 0.5% y tres con PBS de 5 minutos cada uno en agitación suave, para enseguida incubar por 1 hora con el segundo anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa a una dilución 1:1000 en PBS-leche 3%, se hicieron tres lavados con PBS, dos lavados con PBS-Tween 20 0.5% y tres con PBS. La bandas inmunorreactivas de las cepas de E. coli adherentes y no adherentes al colágeno tipo IV se revelaron utilizando como sustrato diaminobencidina (Sigma) (0.25 g de diaminobencidina en 50ml de PBS y 7.5 ml de H2O2) y el inmunoblot del grupo de cepas patógenas y de cepas aisladas de aves clínicamente sanas fue revelado con quimiluminiscencia (Amersham- Pharmacia) exponiéndolo a una película Kodak Biomax ML en un casette con pantalla intensificadora.

Resultados:

Figura 1. SDS-PAGE de Omp de cepas de E. coli adherentes (3-6) y no adherentes (7-9) al colágeno tipo IV. 1. ASB; 2. Marcador de peso molecular; 3. YA26 adh. +++; 4.CA4 adh+++; 5.EI35 adh +++; 6. YA21-14 adh +++; 7.YA21-6 adh -; 8. YA4 adh -; 9.K12-711 adh. -.

Figura 2. SDS-PAGE de Omp de cepas de E. coli patógenas (3-5) y cepas de E. coli aisladas de aves clínicamente sanas (6-9). 1. ASB; 2. Marcador de peso molecular; 3.YA21-14; 4. EI35; 5. YA 26; 6. CA2; 7.CA4; 8. CA5; 9. CA1.

Figura 3. Western-blot revelado por diaminobencidina de Omp de cepas de E. coli adherentes al colágeno tipo IV: 1)YA26; 2) YA21-14; 3) EI35; 4) CA4y no adherentes al colágeno tipo IV: 5)YA 2106; 6) YA4; 7) K12-711.

Figura 4. Quimiluminicencia de Omp de cepas de E. coli aviar patógenas: 1)YA2114; 2) EI35; 3)YA26 y cepas de E. coli aisladas de aves clínicamente sanas: 4) CA2; 5) CA4; 6) CA5.

Resultados:

Detección de Omp en cepas adherentes y no adherentes al colágeno tipo 1V
Los estudios de Western blot permitieron detectar diferencialmente una banda que se encuentra en el rango entre 97 y 45 kDa, presente únicamente en las cepas patógenas adherentes (figulas 3 y 4), dicha banda no se detectó en las Omp de la cepa indígena CA4 adherente al colágeno (fig. 4).

Detección de Omp en cepas APEC y en cepas indígenas aisladas de pollos sanos
El análisis de los PAGE-SDS, permitió detectar además de las Omp principales OmpF y OmpC ampliamente descritas, una banda de aproximadamente 39 kDa exclusivamente en las cepas patógenas. En contraste, en los patrones de las Omp de cepas aisladas de pollos sanos, únicamente se detectaron las dos bandas de 38,000 y 37,000 características.

Discusion:

Es un gran reto entender como se desarrolla la fisiopatología de la colisepticemia aviar y la manera como E. coli utiliza sus moléculas de superficie en eventos específicos. Un hallazgo sorprendente al analizar los PAGE-SDS fue el encontrar claras diferencias entre las Omp principales de las cepas APEC y las de la flora indígena. Detectándose claramente una banda de Omp de peso aproximado de 39 kDa (fig. 2), además de las esperadas OmpF y OmpC en las patógenas, inclusive, en la figura 1 se visualiza que las Omp de las cepas CA4 de flora indígena (carril 4) y de la cepa de laboratorio avirulenta K12 711 (carril 9) únicamente presentan dos bandas, quizá parte de estos resultados se deban al rigor con que se seleccionaron las cepas indígenas, ya que de 80 aislamientos de E. coli provenientes de pollos clínicamente sanos únicamente se seleccionaron cinco que mostraron ser ColV- y fimbria tipo 1 negativos (), características asociadas a la patogenicidad , por lo que será importante ampliar estos estudios para elucidar si esta banda adicional corresponde a PhoE así como su papel en la patogenia e inmunogenicidad en la colisepticemia aviar.

Resulta interesante observar los resultados de los estudios en Western blot, ya que se detectó una banda característica en los rangos entre 97 kDa y 45 kDa únicamente en las Omp de cepas patógenas adherentes al colágeno tipo (no se detectó en las cepas APEC YA4 ni en la YA2106, no adherentes). En contraste, dicha banda no se observó en la cepa indígena CA4, a pesar de ser adherente al colágeno tipo IV (figura 3). Es importante mencionar que una cepa, la YA4, a pesar de ser muy virulenta (DL50 1.6X107) () no mostró la capacidad de adherencia al colágeno tipo IV ni presentó el patrón de Omp observado en las cepas patógenas adherentes, lo que pudiera ser indicativo de que dicha banda podría estar relacionada con la capacidad de adherencia bacteriana a esta proteína de la matriz extracelular. Sin embargo, será necesario realizar pruebas más finas utilizando anticuerpos específicos contra esta Omp para elucidar su papel como adhesina. Asimismo, estos hallazgos corroboran la gran diversidad de fenotipos asociados a la patogenicidad.

Por otro lado, de las cepas de E. coli aisladas de pollos clínicamente sanos, la CA4, a pesar de ser adherente al colágeno tipo IV, no presentó la banda característica que presentaron las cepas patógenas adherentes, lo que pudiera ser indicativo de que se requieren otros atributos, presentes en las cepas APEC, pero no en las indígenas para que se exprese esta proteína.

El conocimiento cabal de los eventos que interactúan durante el desarrollo de la colibacilosis aviar, permitirá desarrollar estrategias para su prevención y control, de manera objetiva.

Reconocimientos:

Conacyt: 3788-M
Universidad Autónoma de Zacatecas.

Literatura Citada

1. Walker, S.: Clasificación, estructura y funcionamiento de las bacterias, en Microbiología, macGraw Hill Interamericana. México 2000.

2. Nikaido H. : Outer memmbrane in Escherichia coli and Salmonella cellular and molecular biology. Neidhardt, F. Editor in chief. 2d. Ed., ASM Press. 1999

3. Henderson, B., Poole, S., and Wilson, M.: Bacterial modulins: a novel class of virulence factors wich cause host tissue by inducing cytokine síntesis. Microv. Rev. 60 (2): 316-341. 1996.

4. Williams, K., Bigley III, E., and Raybourne, R.: Identification of murine B-cell and T-cell epitopes of Escherichia coli outer membrane protein F with syntetic polipeptides. Infect. Immun. 68 (5): 2535-2545. 2000.

5. Jubier-Maurin, V., Biogegrain, A., Cloeckaert , A., Gross, A., Álvarez-Martínez, M., Terraza, A., Liautard, J., Köhler, S., Rouot, B., Dornand, J., and Liautard, J.: Major outer membrane protein Omp25 of Brucella suis is involved in inhibition of tumor necrosis factor alpha production during infection of human macrophages. Infect. Immun. 69 (8): 4823-4830. 2001.

6. Prasadarao, N., Wass, C., Stins, M., Huang, S. and Kim, K.: Outer membrane protein A of Escherichia coli contributes to invasion of brain microvascular endothelial cells . Infect. Immun. 64 (1): 146-153. 1996.

7. Prasadarao, N., Wass, C., and kim, K.: Endotelial cell GlcNAcß1-4GlcNAc epitopes for outer membrane protein A enhance traverssal of Escherichia coli across the blood-brain barrier. Infect. Immun. 64 (1): 154-160. 1996.

8. Prasadarao, N., Wass, C., Stins, M., Shimada, H., and Kim, K.: Outer membrane protein A-promoted actin condensation of brain microvascular endothelial cells is required for Escherichia coli invasion. Infect. Immun. 67 (11): 5775-5783. 1999.

9. Weiser, J. and Gotschlich G.: Outer membrane protein A (OmpA) contributes to serum resistance and pathogenicity of Escherichia coli K-1 . Infect. Immun. 59(7): 2252-2258. 1991.

10. Schulze-Koops, H., Burkhardt, H., Heesemann, J., Kirsh, T., Swuboda, B., Bull, C., Goodman, S. and Emmrich, F.: Outer membrane protein YadA of enteropathogenic yersiniae mediates specific binding to cellular but not plasma fibronectin. Infect. Immun. 61 (6): 2513-2519. 1993von der Mark, K.,

11. Schulze-Koops, H., Burkhardt, H., Heesemann, J., von der Mark, K., and Emmrich, F.: plasmid-encoded outer membrane protein YadA mediates specific binding of enteropathogenic Yersiniae to various types of collagen. Infect. Immun. 60(6): 2153-2159.1992.

12. Tafazoli, F., Holmström, A., Forsberg, A., and magnusson, K.: Apically exposed, tight junction-associated ß1-integrins allow binding and YopE-mediated perturbation of epithelial barriers by wild-type Yersinia bacteria. Infect. Immun. 68 (9): 5335-5343. 2000.

13. Kresse, A., Rohde, M., and Guzmán, C.: The EspD protein of enterohemorragic Escherichia coli is requuired for the formation of bacterial surface appendages and is incorporated in the cytoplasmic membranes of target cells. Infect. Immun. 67 (9): 4834-4842. 1999.

14. Blanco, M., Blanco, J. Mora, A., y Blanco J.: Escherichia coli septicémicos aviares: serotipos, factores de virulencia, resistencia a los antibióticos y desarrollo de vacunas. Med. Vet. 13: 525-535. 1996.

15. Emery, D., Naraja, K., Sivandan, JV., Lee, B., Zhang, C. And Newman, J.: Endotoxin lipopolysaccharide from Escherichia coli and its effects on thephagocytic function of systemic and pulmonary macrophages in turkey avian. Avian Dis. 35: 901-909. 1991.

16. López, J.: Escherichia coli: mechanisms de patogenicidad. Ciencia Vet. :1-99. 1975.

17. Dho-Moulin, M. And Fairbrother M.: Avian pathogenic Escherichia coli (APEC). Vet. Res.: 299-316. 1999.

18. Sánchez Villanueva C.: Adherencia de Escherichia coli patógena aviar al colágeno de la matriz extracelular. Tesis M. en C. U.A.Z. 2001.

19. Kapur V., Withe, D., Wilson, R., and Whittam, T.: Outer membrane protein patterns mark clones of Escherichia coli O2 and O78 strains that cause avian septicemia. Infect. Immun. 60(4): 1687-1691. 1992.

20. Ramírez, R., Moreno, A. Y Almanza Y.: Factores de virulencia de Escherichia coli asociados a la colisepticemia en pollos de engorde. Rev. Arg. Microbiol. 33:52-57. 2001.

21. Gallagher, S. And Smith, J.: Electrophoretic separation of proteins. In: Current protocols in molecular biology. Edited by:Ausubel, F. 2: 10.2.1.-10.- 10.2.21. Massachusetts general Hospital Harvard Medical School. Massachusetts. 1991.